一、服務介紹

       將一個已知蛋白作為 “誘餌”，通過基因工程技術給其添加一個特異性標簽（如 GST、His、Flag 等）。將帶標簽的誘餌蛋白與對應的親和介質（如 GST - 谷胱甘肽樹脂、His-Ni2?樹脂）結合，使誘餌蛋白被固定在介質表面。將固定有誘餌蛋白的介質與含潛在 “靶蛋白” 的樣品（可以是細胞裂解液、純化的蛋白等）共同孵育。若靶蛋白與誘餌蛋白存在特異性相互作用，就會被誘餌蛋白捕獲，形成 “誘餌 - 靶蛋白復合物” 并結合在介質上；無相互作用的雜蛋白則游離在溶液中。

二、亮點和服務特色

2.1 亮點

       1）蛋白間相互作用  2）高特異性  3）高靈敏度  4）適用于多種生物體系

2.2 服務特色

       GST Pull-Down 是一種基于親和層析和蛋白質 - 蛋白質相互作用的體外實驗技術，核心目的是驗證兩種已知蛋白質是否存在直接相互作用，或從復雜樣品（如細胞裂解液）中篩選出與目標蛋白質結合的未知互作蛋白。

三、 服務優勢

    1. 高特異性：實驗的特異性由 “親和標簽 - 載體” 和“蛋白 - 蛋白互作” 雙重機制保障，大幅減少非特異性結合帶來的干擾。

    2. 靈活可控：GST Pull-Down 的體外實驗體系具有極強的靈活性，可根據研究目標自由調節關鍵條件，滿足多樣化需求。

    3. 直接驗證：GST Pull-Down 是體外重建的簡化體系：實驗中僅包含 “GST - 誘餌蛋白”、“獵物蛋白”（及必要緩沖成分），若能檢測到獵物蛋白，可直接證明二者存在不依賴其他內源蛋白的直接相互作用。

四、 服務流程

五、客戶提供

    蛋白序列信息

    1. 提供載體/模板：需要提供載體mcs測序報告/模板測序結果，如：測序報告則需另外收取測序費，由載基代為測序。

    2. 提供菌液：菌液量應≥0.5mL，放置1年以上的油菌需活化后送樣。

    3. 提供質粒：質粒量≥5μg。

    4. 菌液和液態質粒均需冰袋運輸。

六、實驗交付

    1. 剩余質粒；

    2. 蛋白表達鑒定SDS-PAGE結果、蛋白純化表達SDS-PAGE結果，蛋白Western Blot鑒定結果；

    3. 結題報告以及全部原始數據。

七、服務說明

    1. 可根據樣本蛋白序列及基因序列進行蛋白表達預測分析，選擇合適的載體與菌株，構建載體后進行誘導表達與蛋白純化；

    2. 小量誘導蛋白表達SDS-PAGE、大量蛋白純化進行互作實驗分析；

    3. 在陰陽對照正常的前提下，若實驗組IP中檢測到另一蛋白條帶，陰性對照中沒有，說明兩個蛋白能夠互作，反之說明不互作。

八、案例展示

    1取自未誘導的菌液，2取自誘導后的菌液，3取自超聲破碎后的菌沉淀，4取自超聲破碎后的上清。

九、相關資源

1、GST-pull down 技術應用

    1) 蛋白質互作驗證：直接驗證體外條件下兩個或多個已知蛋白質之間的特異性相互作用，明確互作的直接性與結合強度。

    2) 未知互作蛋白篩選：以目標蛋白為誘餌，從細胞裂解液、組織提取物等復雜樣品中捕獲并鑒定潛在的互作蛋白，挖掘新的功能關聯分子。

    3) 蛋白質結合結構域分析：通過構建誘餌蛋白的截短體或突變體，確定介導蛋白質相互作用的關鍵結構域或氨基酸位點。

    4) 蛋白質 - 核酸互作研究：檢測蛋白質與特定 DNA 或 RNA 序列的結合能力，如轉錄因子與啟動子的相互作用、RNA 結合蛋白與靶標 RNA 的結合等。

    5) 藥物研發輔助：篩選能干擾或促進特定蛋白質相互作用的小分子化合物，評估候選藥物對靶標互作的影響，為藥物靶點驗證提供依據。

    6) 信號通路解析：鑒定信號通路中關鍵蛋白的上下游互作分子，闡明信號傳遞的分子機制，如激酶與底物、受體與配體之間的相互作用關系。

    7) 微生物學研究：探究病原微生物蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用，揭示病原體入侵、感染及致病的分子機制。

    8) 蛋白質翻譯后修飾對互作的影響：分析磷酸化、泛素化等翻譯后修飾是否調控蛋白質之間的相互作用，以及修飾后的互作強度變化。

2、GST-pull down 實驗流程

    1) 構建與表達 GST 融合蛋白：設計特異性引物擴增目的基因（誘餌蛋白），將其與 GST 標簽基因融合并克隆到原核表達載體中，轉化大腸桿菌后通過 IPTG 誘導表達 GST - 誘餌融合蛋白，經親和層析純化獲得高純度融合蛋白。

    2) 制備待檢測樣品：若檢測與已知蛋白的互作，需表達并純化該目標蛋白（可帶 His 等標簽便于后續檢測）；若篩選未知互作蛋白，則裂解細胞或組織，離心取上清獲得總蛋白提取物。

    3) 孵育與結合：將純化的 GST - 誘餌融合蛋白與 GST 親和樹脂孵育，使融合蛋白通過 GST 標簽結合到樹脂上；加入待檢測樣品（目標蛋白或總蛋白提取物），在適宜條件（如 4℃）下緩慢搖晃孵育，讓互作分子充分結合。

    4) 洗滌與分離：用含不同濃度鹽離子的緩沖液多次洗滌樹脂，去除非特異性結合的蛋白；加入洗脫緩沖液（如含還原型谷胱甘肽）洗脫結合的蛋白復合物。

    5) 檢測與分析：通過 SDS-PAGE 分離洗脫的蛋白復合物，若為已知互作蛋白，可經 Western Blot（用標簽抗體或特異性抗體）驗證；若為篩選未知蛋白，則對凝膠中的特異性條帶進行質譜鑒定，確定互作蛋白身份。

3、GST-pull down 實驗優化與注意事項

    1) 融合位點選擇需避開誘餌蛋白的功能結構域（如結合活性位點、酶活中心），避免 GST 標簽干擾蛋白互作；優先選擇 N 端或 C 端融合（若某一端融合影響蛋白折疊，可嘗試另一端）。

    2) 確保融合蛋白正確折疊與活性：通過 SDS-PAGE 驗證純化后蛋白的純度（目標條帶單一，無明顯雜帶），若需進一步確認活性，可結合酶活實驗（針對酶類誘餌）或已知互作蛋白的預實驗（驗證結合能力），避免因蛋白錯誤折疊導致假陰性。

    3) 溫度與時間：常規選擇 4℃孵育（減少蛋白降解，降低非特異性結合），孵育時間需根據互作強度調整（弱互作可延長至 12-16 小時，強互作 4-6 小時即可），避免過短導致結合不充分或過長增加非特異性結合。

    4) 緩沖液成分：緩沖液需含溫和的鹽離子（如 100-150mM NaCl，過高易破壞互作，過低增加非特異性結合）、蛋白酶抑制劑（如 PMSF、蛋白酶抑制劑 cocktail，防止蛋白降解）和磷酸酶抑制劑（若研究磷酸化依賴的互作）；可添加 0.1%-0.5% Triton X-100 增強蛋白溶解性，但需避免高濃度去污劑破壞蛋白互作。

    5) 洗滌緩沖液需與孵育緩沖液成分一致（僅可調整鹽濃度），通過梯度提高鹽濃度（如從 150mM 逐步升至 300mM NaCl）去除非特異性結合蛋白，同時需檢測目標互作是否被高鹽破壞（可通過預實驗驗證）。

    6) 洗滌次數與體積：每次洗滌需用至少 10 倍樹脂體積的緩沖液，反復洗滌 3-5 次，確保充分去除未結合或弱結合的雜蛋白，但避免過度洗滌導致特異性復合物脫落。

    7) 對照實驗的設置（關鍵防假陽性 / 假陰性）：陰性對照：① 僅用 GST 蛋白（無誘餌片段）與樹脂結合后孵育待檢測樣品，排除 GST 標簽本身與目標蛋白的非特異性結合；② 待檢測樣品單獨與樹脂孵育，排除樣品中蛋白與樹脂的非特異性吸附。陽性對照：使用已知與誘餌蛋白互作的蛋白作為待檢測樣品（如已報道的互作對），驗證實驗體系的有效性，確保實驗流程無技術誤差。

    8) 待檢測樣品（細胞 / 組織裂解液）需新鮮制備，避免反復凍融導致蛋白降解；離心時需保持低溫（4℃），且轉速足夠（如 12000g 離心 15 分鐘），確保去除細胞碎片，避免雜質干擾結合。

    9) 檢測方法選擇：若驗證已知互作，Western Blot 需使用特異性抗體（如目標蛋白的標簽抗體或自身抗體），確保抗體特異性（無交叉反應）；若篩選未知互作，SDS-PAGE 凝膠需選擇合適濃度（根據目標蛋白分子量），且質譜鑒定前需切取清晰的特異性條帶（避開 GST 誘餌蛋白條帶），減少雜蛋白干擾。

    10) 純化過程中需避免反復凍融 GST 融合蛋白，可將純化后的蛋白分裝保存于 - 80℃，并添加 50% 甘油提高穩定性，防止蛋白變性影響后續結合實驗。