蛋白與蛋白互作
? 服務(wù)介紹
雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC）是一項(xiàng)可直觀、快速判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的技術(shù)。該技術(shù)利用在熒光蛋白特定位點(diǎn)插入外源片段而不影響熒光活性的特性，將其分割為兩個(gè)無熒光活性的蛋白片段，即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment），當(dāng)能夠發(fā)生相互作用的兩個(gè)蛋白分別與N端片段和C端片段連接形成融合蛋白并在活細(xì)胞中共同表達(dá)時(shí)，熒光蛋白的N端片段與C端片段就能夠相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光。
? 實(shí)驗(yàn)流程
1. 載體構(gòu)建
克隆目標(biāo)蛋白基因：將目標(biāo)蛋白A和B的基因分別克隆到含有熒光蛋白N端片段(VN)和C端片段(VC)的載體上。
構(gòu)建融合表達(dá)載體：構(gòu)建兩個(gè)融合表達(dá)載體，如pBiFC-VN-A和pBiFC-VC-B。
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
共轉(zhuǎn)染：將上述兩種載體共轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體或酵母）。可以選擇適當(dāng)?shù)膶?duì)照實(shí)驗(yàn)，例如單獨(dú)轉(zhuǎn)染VN-A或VC-B以驗(yàn)證無自發(fā)熒光。
3. 熒光檢測
顯微鏡觀察：在特定激發(fā)光下（如YFP: 激發(fā)光514nm，發(fā)射光527nm），通過顯微鏡直接觀察熒光信號(hào)。
時(shí)間分辨成像：動(dòng)態(tài)監(jiān)測相互作用發(fā)生的時(shí)間窗口。
