蛋白與蛋白互作
? 服務介紹
酵母雙雜交系統的建立基于對真核生物轉錄調控機制的深入認識，其核心原理是利用轉錄激活因子的組件式結構特性探測蛋白質之間的相互作用。真核生物的轉錄激活因子（如酵母GAL4蛋白）通常由兩個功能獨立的結構域組成：DNA結合結構域（DNA-BD）：負責識別并結合靶基因上游的特定DNA序列（如GAL4的上游激活序列UAS）。轉錄激活結構域（AD）：通過與轉錄 machinery 其他成分結合，啟動下游基因的轉錄。這兩個結構域單獨存在時無法激活轉錄，但當它們通過蛋白質相互作用在空間上接近時，可重建完整的轉錄因子活性，從而激活報告基因的表達。
? 實驗流程
一、載體構建-獲取目的基因
通過PCR等方法從相應的DNA模板中擴增出編碼待研究蛋白質的基因序列。
二、構建誘餌載體
將目的基因克隆到含有酵母轉錄因子DNA結合結構域（BD）的載體上，構建成誘餌載體。
三、構建獵物載體
將可能與誘餌蛋白相互作用的蛋白質的基因克隆到含有酵母轉錄因子激活結構域（AD）的載體上，得到獵物載體。
四、酵母菌株的選擇與準備
1、選擇合適的酵母菌株：根據實驗需求選擇合適的酵母菌株，常見的有Y2HGold等菌株。
2、酵母感受態細胞的制備：采用化學方法或電轉化法將酵母細胞制備成感受態細胞，以便于后續的載體轉化。
3、轉化酵母細胞-共轉化：將構建好的誘餌載體和獵物載體同時轉化到酵母感受態細胞中。
4、篩選陽性轉化子：利用載體上攜帶的篩選標記，如營養缺陷型標記，在相應的篩選培養基上篩選出同時含有誘餌載體和獵物載體的陽性轉化子。
五、相互作用檢測
1、報告基因檢測：如果誘餌蛋白和獵物蛋白發生相互作用，會使酵母轉錄因子的BD和AD結構域相互靠近，從而激活報告基因的表達。通過檢測報告基因的表達情況，如β-半乳糖苷酶活性、熒光素酶活性等，來判斷蛋白質之間是否發生相互作用。
2、酵母表型分析：有些報告基因的表達會導致酵母細胞在特定培養基上出現生長或顏色變化等表型，通過觀察酵母細胞的表型來判斷蛋白質相互作用。
六、結果驗證
1、重復實驗：為確保結果的可靠性，需要進行多次重復實驗。
2、其他實驗驗證：采用其他技術如免疫共沉淀、GST-pull down等實驗進一步驗證蛋白質之間的相互作用。
