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? 服務介紹

       免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是基于抗原-抗體特異性結合原理的親和純化技術，廣泛用于從細胞或組織裂解物中富集、分離天然靶蛋白。其核心流程包括樣品制備、抗體孵育、復合物捕獲、洗滌及洗脫分析，可延伸為Co-IP（免疫共沉淀）用于檢測蛋白相互作用，或結合ChIP（染色質免疫沉淀）研究蛋白質與DNA的結合。

? 實驗步驟

一、樣品制備與預處理

• 細胞裂解：需使用低濃度去垢劑（如RIPA裂解液）避免干擾抗原-抗體結合，單管IP推薦初始裂解物體積0.2-0.4 mL（含1-3 mg總蛋白），并添加1.5-2倍常規用量的蛋白酶抑制劑。總蛋白濃度可通過Bradford或BCA法測定。
• 預處理步驟：富含IgG的樣品需用Protein A/G瓊脂糖珠（30 μL/1-3 mg蛋白）4℃旋轉孵育60分鐘，500g離心1分鐘去除非特異性結合雜質。

二、免疫沉淀核心步驟

1. 抗體孵育：取200-400 μL預處理裂解物，加入1-4 μg特異性抗體及孵育液，4℃旋轉孵育2-4小時或過夜；同時設置同型IgG對照組排除非特異性結合。
2. 復合物捕獲：加入50 μL Protein A/G珠子，4℃孵育1-4小時后離心棄上清，用含蛋白酶抑制劑的1×TBST洗滌4-5次，每次500g離心30秒。
3. 洗脫與檢測：加入20 μL 5×SDS上樣緩沖液，95-100℃煮沸5分鐘，離心后取上清進行SDS-PAGE及WB分析。WB檢測時建議使用HRP-抗兔輕鏈二抗或HRP-Protein A以減少抗體重鏈干擾。