蛋白與核酸互作
? 服務介紹
甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP/m6A-seq）是通過特異性抗體富集含m6A修飾的RNA片段，結合高通量測序或qPCR分析轉錄組-wide甲基化分布的技術。利用抗m6A抗體與隨機打斷的RNA片段孵育，沉淀修飾片段后進行下游檢測（測序/qPCR）。
? 實驗步驟
1. Total RNA樣品檢測
在進行MeRIP實驗之前，首先需要對RNA樣品進行檢測以確保其質量和數量滿足后續實驗的要求：
瓊脂糖凝膠電泳分析：檢測RNA的降解程度及是否存在污染，確保具有明顯的18S或28S主帶且條帶清晰。
Qubit2.0精確量化：對RNA濃度進行精確測量，總RNA檢測總量不低于10μg。
Agilent2100完整性檢測：檢測RNA的完整性，RIN值不低于7.5。
2. RNA片段化
取10μg總RNA，加入RNA片段化試劑（如Invitrogen提供的試劑），在70℃下反應10分鐘，將RNA打斷成約100nt的片段。隨后使用乙醇法將片段化的RNA沉淀。
3. m6A富集
這是MeRIP實驗的核心步驟之一，旨在通過抗體特異性結合m6A修飾的RNA片段來富集目標RNA：
將含有Protein A和Protein G的磁珠用IP緩沖液（如150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5）洗滌。
與5μg m6A抗體（如Millipore提供的抗體）在4℃下孵育2小時。用IP緩沖液洗滌磁珠兩次，再用IP緩沖液重懸磁珠，加入片段化的RNA，在4℃下翻轉孵育4小時。
用IP緩沖液在4℃下洗滌磁珠三次，再用m6A競爭性洗脫液在4℃下孵育1小時。
收集含有洗脫m6A RNA的上清至新的試管中，并使用苯酚:氯仿:3-甲基丁醇（125:24:1）進行純化。
4. 文庫構建
使用SMARTer? Stranded Total RNA-seq Kit v2-Pico Input Mammalian User Manual根據說明書對IP與Input樣品進行反轉錄及文庫構建。利用AMPure XP bead進行片段大小選擇，獲得最終文庫。
5. 文庫質檢
文庫構建完成后，需要對其進行質量檢測：
使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/μl。
使用Agilent2100對文庫的插入片段大小進行檢測，確保插入片段大小符合預期。
使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度應為2nM），以確保文庫質量。
6. 上機測序
文庫檢測合格后，根據不同文庫的有效濃度及目標下機數據量的需求進行混合，并在Illumina Nova平臺測序，測序策略為PE150。
7. 信息分析流程
原始下機數據質控：對測序數據進行初步處理，去除低質量讀段。
比對參考基因組：將高質量讀段比對到參考基因組上。
peak calling：識別m6A修飾的熱點區域。
功能注釋：對識別出的m6A修飾區域進行功能注釋，分析其可能參與的生物學過程
